Выделение плазмидной ДНК методом центрифугирования

Выделение плазмидной ДНК из Escherichia coli является очень распространенной процедурой в исследовательских лабораториях. Ниже описывается метод, который включает щелочной лизис клеток. Этот протокол позволяет быстро и легко получать достаточно чистую ДНК.

Заполните микроцентрифужную пробирку насыщенной бактериальной культурой, выращенной в бульоне LB с антибиотиком. Открутите пробирку в микроцентрифуге в течение 1 минуты. Снова высушите супернатант и сливную трубку на бумажном полотенце.

Повторите шаг 1 в той же самой трубе, заполняя трубку еще больше бактериальной культурой. Цель этой стадии заключается в увеличении начального объема клеток, так что больше ДНК плазмиды может быть выделено на один препарат. Открутите пробирку в микроцентрифуге в течение 1 мин. Вылейте супернатант и слейте осушите пробирку на бумажное полотенце.

Добавьте 0,2 мл ледяного Раствора 1 в клеточный осадок и повторно суспендируйте клетки, насколько это возможно, с помощью одноразовой пипетки Пастера.

Раствор 1 содержит глюкозу, Трис и ЭДТА. Глюкоза добавляется для увеличения осмотического давления снаружи клеток. Трис - буферный агент, используемый для поддержания постоянного рН 8,0. ЭДТА защищает ДНК от деградирующих ферментов (так называемых ДНКаз). EDTA связывает двухвалентные катионы, которые необходимы для активности ДНКазы.

Добавьте 0,4 мл Раствора 2 в эппендорф и осторожно встряхните пять раз, затем оставьте пробирки при комнатной температуре на 5 мин.

Раствор 2 содержит NaOH и SDS (детергент). Щелочная смесь разрывает клетки, а детергент разрывает липидную мембрану и растворяет клеточные белки. NaOH также денатурирует ДНК в отдельные нити.

Добавьте 0,3 мл охлажденного льдом раствора 3 в микропробирки эппендорф и осторожно встряхните пять раз. Инкубируйте пробирки на льду в течение 10 мин.

Раствор 3 содержит смесь уксусной кислоты и ацетата калия. Уксусная кислота нейтрализует рН, позволяя нитям ДНК восстанавливаться. Ацетат калия также осаждает SDS из раствора вместе с клеточным дебрисом. Хромосомная ДНК E. coli, частично ренатуринованная на этой стадии, также остается в осадке. ДНК плазмиды остается в растворе.

Открутите пробирки в течении 5 мин. Используя чистую одноразовую трансферную пипетку, переносите супернатант в чистую микроцентрифужную пробирку. Старайтесь избегать попадания в пипетку белого осадка во время переноса. Лучше оставить немного супернатанта в пробирке, чтобы избежать случайного попадания осадка.

Эта стадия фракционирования отделяет плазмидную ДНК от клеточного дебриса и ренатурированной хромосомной ДНК.

Заполните оставшуюся часть центрифужной пробирки изопропанолом и оставьте ее на 2 минуты.

Изопропанол эффективно осаждает нуклеиновые кислоты, но гораздо менее эффективен во взаимодействии с белками. Быстрое осаждение может, следовательно, очищать ДНК от белковых примесей.

Центрифугируйте пробирки в течении 5 минут. Гранула молочного цвета должна остаться на дне пробирки. Вылейте супернатант, не выгружая гранулу. Слейте содержимое на бумажное полотенце.

Эта стадия фракционирования дополнительно очищает плазмидную ДНК от загрязняющих веществ.  Закройте пробирки и полжите их в замораживатель.

Добавьте 1 мл ледяного 70% этанола. Закройте пробирку перемешайте содержимое перевернув пробирку несколько раз. Открутите пробирки в течение 1 минуты. Вылейте супернатант (будьте осторожны, чтобы не сбросить гранулы) и слейте содержимое на бумажное полотенце.

Этанол помогает удалить оставшиеся соли и SDS из препарата.

Дайте пробирке высохнуть в течении 5 минут. Добавьте 50 мкл TE в пробирку. При необходимости открутите пробирку небольшое время, чтобы буфер осел на дно. ДНК готова к использованию и может храниться неограниченное время в морозильной камере.