Выделение хлоропластов

Дифференциальное центрифугирование и центрифугирование в градиенте плотности используются для выделения двух органелл растений, а именно хлоропластов и митохондрий. В хлоропластах происходит фотосинтез, процесс, посредством которого зеленые растения преобразуют световую энергию в химическую путем производства углеводов и кислорода с использованием двуокиси углерода и воды. Под микроскопом хлоропласты можно отличить как бобовидные, связанные с мембраной зеленые органеллы. В данной методике описывается выделение и анализ хлоропласта из гомогената клеток путем центрифугирования в градиенте плотности.

Методика

Все растворы и образцы должны храниться на льду:

1. Подготовьте два градиента сахарозы в 50 мл центрифужных пробирках:
   • Внесите 5 мл 60% раствора сахарозы в нижнюю часть каждой пробирки.
   • Слой 5 мл 50% сахарозы, затем 10 мл 40% сахарозы в каждую пробирку.
   • Слои должны отличаться друг от друга. (Подсказка: Наконечник трубки, когда вы добавляете каждый слой сахарозы. Пусть кончик пипетки просто касается поверхности жидкости в трубке).
   • Кончиком пипетки Пастера аккуратно перемешайте поверхности слоев 50% и 40%.
   • Добавьте слой 5 мл 30% сахарозы сверху градиента.
   • Храните градиент на льду, пока вы готовите образец ткани.
2. 5 грамм 7-дневных ростков гороха срезанных острым лезвием на линии грунта.
3. Измельчите ростки на мелкие кусочки бритвенным лезвием или ножницами и перенесите их в охлажденный блендер, содержащий 20 мл ледяного гомогенизирующего буфера.
4. Гомогенизируйте с пятью 2-3-секундными всплесками блендера с высокой скоростью. 
5. Отфильтруйте гомогенат в прерыватель (на льду) через четыре слоя марли, аккуратно сжимая ткань, чтобы удалить большую часть жидкости.
6. Отфильтруйте первый фильтрат через один слой мирака, увлажненный в буфере гомогенизации, под действием силы тяжести.
7. Нанесите слой 10 мл фильтрата на вершину каждого из ваших градиентов (подготовлен на этапе 1). Убедитесь, что два градиента сбалансированы друг против друга. При необходимости добавьте буфер гомогенизации, чтобы уравновесить пробирку.
8. Центрифугируйте при 4°C и 4000 об/мин в течение 5 минут, затем увеличьте скорость до 10 000 об / мин в течение 10 мин. Позвольте центрифуге остановиться. Осторожно удалите градиенты с ротора.
9. В градиенте появляются две зеленые полосы. Зеленая полоса к нижней части трубки представляет собой фракцию, содержащую неповрежденные хлоропласты. Тщательно удалите верхнюю часть градиента с помощью пипетки Пастера. Сохраните две фракции хлорофилла отдельно в чистых трубах на льду.
10. Подготовьте слайды с мокрым креплением фракций, содержащих хлорофилл, и изучите их на микроскопе.
11. Проанализируйте содержание хлорофилла в двух зеленых полосах. Для каждого образца
• В чистую центрифужную пробирку пипеткой нанесите 50 мкл фракции градиента и 0,95 мл дистиллированной воды.
• Добавить 4 мл ацетона.
• Центрифугируйте в клинической центрифуге (5 мин).
• Измерьте поглощение раствора с помощью спектрофотометра UV-Vis при 652 нм.
12. Рассчитайте содержание хлорофилла по формуле: A₆₅₂ × 29 = мкг хлорофилла в 10 мкл хлоропластовой фракции
13. Заморозьте и сохраните целую фракцию хлоропластов для изоляции ДНК.