Gateway-клонирование

Рекомбинантное клонирование Gateway® — элегантный способ обойти трудности традиционного клонирования, позволяющий создать систему экспрессии с практически любыми параметрами. На данный момент опубликовано более 1 500 научных работ с участием технологии Gateway®.

Преимущества:

• Доля целевых клонов – 99%;
• Время реакции – 1 час при комнатной температуре;
• Всегда правильная ориентация рамки считывания вставки;
• Клонирование без эндонуклеаз обеспечивает целостность целевого гена;
• Нет необходимости в ресеквенировании в процессе создания системы экспрессии;
• Простой и надёжный механизм обмена вставками между векторами;
• Масштабируемость – совместимость с высокопроизводительным скринингом.

Природный прототип технологии

Технология Gateway® базируется на хорошо изученном механизме интеграции фага λ в геном E.coli. После инфицирования участок attP ДНК фага рекомбинирует с участком attB ДНК E.coli. Сайт-специфическая рекомбинация проходит при участии интегразы фага (Int) и клеточного фактора интеграции (IHF). В результате реакции ДНК фага оказывается встроенной в геном бактерии и фланкирована сайтами attL и attR, каждый из которых содержит фрагменты attP и attB. Обратная реакция между attL и attR приводит к вырезанию ДНК фага и восстанавливает первоначальные сайты attP и attB.

Рекомбинация как инструмент клонирования

Реакция Gateway® BP – это реакция рекомбинации in vitro между двумя разными сайтами attB (attB1 и attB2) одной молекулы ДНК и двумя сайтами attP (attP1 и attP2) другой молекулы. В результате реакции между молекулами ДНК происходит обмен фрагментами, заключёнными между сайтами att с образованием сайтов attL1 и attL2 в одной молекуле и сайтов attR1 и attR2 – в другой. Стоит отметить, что сайт attB1 рекомбинирует с attP1 и не рекомбинирует с attP2 и т.д., поэтому после завершения реакции не образуется никаких нежелательных конструкций. Для получения исходных конструкций можно провести обратную реакцию Gateway® LR. Реакции BP и LR – основа клонирования Gateway®.

Этапы клонирования:

• Создание исходного вектора – вектора, в котором целевой ген фланкирован сайтами att. Варианты:
• использование специального вектора TOPO® с сайтами att;
• клонирование продукта ПЦР, достроенного сайтами attB, в один из векторов pDONR™;
• клонирование продукта ПЦР, достроенного сайтами рестрикции, в один из векторов pENTR™;
• приобретение подходящего клона из коллекции Ultimate™ ORF.
• Создание экспрессионного клона – сайт-специфическая рекомбинация между сайтами att в исходном и целевом векторах, трансформация и селекция E.coli.