Применение секвенирования нового поколения

Секвенирование нового поколения (NGS), массовое параллельное или глубокое секвенирование - это родственные термины, которые описывают технологию секвенирования ДНК, которая произвела революцию в геномных исследованиях. Используя NGS, весь человеческий геном можно секвенировать в течение одного дня. Предыдущая технология, используемая для расшифровки генома человека, потребовала более десяти лет, чтобы получить окончательные результаты. Хотя в исследованиях генома NGS в основном вытеснила традиционную секвенацию, она еще не перешла в рутинную клиническую практику. Цель этой статьи - проанализировать потенциальные применения NGS.

Секвенатор Ion GeneStudio™ S5

Существует множество платформ использующих различные технологии секвенирования, подробное обсуждение которых выходит за рамки этой статьи. Однако на всех платформах NGS параллельно выполняется чтение последовательности миллионов мелких фрагментов ДНК. Биоинформатический анализ используется для объединения этих фрагментов путем сопоставления отдельных данных с эталонным геномом. Каждый из трех миллиардов оснований в геноме человека секвенирован несколько раз. NGS можно использовать для решения последовательности целых геномов или с ограничениями по конкретным областям, включая все 22 000 кодирующих генов (экзом) или небольшое количество отдельных генов.

Возможности использования NGS в клинических исследованиях.

Клиническая генетика

Существует множество возможностей использовать NGS в клинической практике для улучшения диагностики и процесса лечения пациента, в том числе:

NGS фиксирует более широкий спектр мутаций, чем секвенирование по методу Сэнгера.

Спектр изменения ДНК в геноме человека включает небольшие изменения (замены), вставки и делеции, большие геномные делеции экзонов или целых генов и перегруппировки, такие как инверсии и транслокации. Традиционное определение по Сэнгеру ограничивается открытием замещений и небольших вставок и делеций. Для оставшихся мутаций часто проводятся специализированные анализы, такие как гибридизация флуоресценции in situ (FISH) для обычных кариотипов или микромассивов сравнительной геномной гибридизации (CGH) для обнаружения изменений субмикроскопических хромосомных копий, таких как микроделеции. Однако эти данные также могут быть получены из данных секвенирования NGS напрямую, что устраняет необходимость в специализированных анализах при сборе полного спектра геномных изменений в одном эксперименте. Ограничения находятся в районах, которые ошибочно отображаются из-за выского содержания гуанина/цитозина (GC) или повторяющейся архитектуры, например, повторных экспансий, связанных с болезнью Хантингтона.

NGS позволяет исследовать последовательность без предсказания и начальных данных

Капиллярное секвенирование зависит от предсказания последовательности исследуемого гена или локуса. Однако NGS совершенно неселективна и используется для решения последовательности полных геномов или экзомов, чтобы обнаружить совершенно новые мутации и гены, вызывающие болезни. В педиатрии это можно было бы использовать, чтобы разгадать генетическую основу необъяснимых синдромов. Например, общенациональный проект «Расшифровка нарушений развития», работающий в Институте Wellcome Trust Sanger в сотрудничестве с клиническими генетическими службами NHS, направлен на распутывание генетической основы необъяснимой задержки развития путем секвенирования геномов детей и их родителей, чтобы выявить вредные варианты de novo. Объединение этих молекулярных данных с подробной клинической фенотипической информацией было успешным в выявлении новых генов, мутировавших у пораженных детей с аналогичными клиническими признаками.

Повышенная чувствительность NGS позволяет обнаруживать мозаичные мутации

Мозаичные мутации приобретаются как событие происходящее после оплодотворения, и, следовательно, они присутствуют с переменной частотой в клетках и тканях человека. Капиллярное упорядочение может пропустить эти варианты, поскольку они часто присутствуют в количестве, которое находится ниже порога чувствительности технологии. Секвенирование NGS обеспечивает гораздо более чувствительное считывание и поэтому может использоваться для идентификации вариантов, которые находятся всего в нескольких процентах клеток, включая изменение мозаики. Кроме того, чувствительность секвенирования NGS может быть дополнительно увеличена путем увеличения глубины секвенирования. Это показало, что NGS применяли для очень чувствительных исследований, таких как считывание фетальной ДНК из материнской крови или отслеживание уровней опухолевых клеток в крови больных раком.

Микробиология

Основной полезностью NGS в микробиологии является замена традиционной характеристики патогенов морфологией, свойствами окрашивания и метаболическими критериями с геномным определением патогенов. Геномы патогенов показывают, что они собой представляют, могут содержать информацию о чувствительности к лекарственным средствам и сообщать о взаимосвязи разных патогенов друг с другом, которые могут использоваться для отслеживания источников вспышек инфекции. NGS использовалось для выявления и отслеживания вспышки устойчивой к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA) в отделении интенсивной терапии новорожденных в Великобритании. Что наиболее примечательно, так это то, что рутинное микробиологическое наблюдение не показало, что случаи MRSA, которые произошли в течение нескольких месяцев, были связаны. Однако NGS патогенов позволили точно определить изоляты MRSA и выявили затяжную вспышку

Онкология

Основополагающей предпосылкой геномики рака является то, что рак вызван соматически приобретенными мутациями, и, следовательно, он является заболеванием генома. Хотя капиллярное секвенирование используется уже более десятилетия, эти исследования были ограничены относительно небольшим количеством образцов и небольшим количеством генов-кандидатов. С появлением NGS, геномы раковых клеток теперь могут быть изучены полностью. Для ребенка, страдающего от рака, это может обеспечить многие преимущества, в том числе более точный диагноз и классификация заболевания, более точный прогноз и, возможно, выявление причинно-следственных мутаций. Таким образом, индивидуальное планирование может стать основой персонализированного лечения рака. В настоящее время существуют экспериментальные проекты с использованием NGS в клинической практике, главным образом для выявления мутаций в опухолях, которые могут быть использованы для получения мутационных препараты.

Ограничения метода

Основным недостатком NGS в клинических условиях является создание необходимой инфраструктуры, такой как компьютерная емкость и хранение, а также кадровый опыт, необходимый для всестороннего анализа и интерпретации последующих данных. Кроме того, объем данных должен использоваться умело, чтобы извлечь клинически важную. Фактическая себестоимость NGS незначительна. Однако, чтобы сделать NGS экономически эффективным, пришлось бы запускать анализ большого количества образцов, которые могут потребовать сложной централизации. После первоначальных капиталовложений NGS может предоставлять услуги в национальном масштабе, которые, вероятно, будут экономически выгодны в дополнение к улучшению лечения пациентов.

Компания Пущинские лаборатории предлагает оборудование для секвенирования производства Thermo Fisher Scientific. Мы всегда готовы проконсультировать вас по данному оборудованию, а также оказать техническую и методическую поддержку